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色谱系统适用性试验在分析方法使用中的重要性

     色谱方法一般包括纸色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、分子排阻色谱、毛细管电泳等。色谱系统适用性试验色谱分析方法中扮演非常重要的角色,尤其是对试验条件( 流动相、不同品牌或不同批号色谱柱、不同品牌仪器) 较为敏感的分析方法。

 

 

1 系统适用性试验的定义

 

 

   液相色谱典型的变动因素有被测溶液的稳定性、不同仪器、不同分析人员、流动相的pH 值和组成、不同厂牌或批号的色谱柱、柱温和流速

气相色谱法典型的变动因素有不同批号或供应商的色谱柱以及温度、流速等

系统适用性必须基于仪器、电子元件、分析方法操作以及被测物是一个整体的系统。系统适用性试 验的参数由所评价的分析方法决定。

 

对于色谱法,系统适用性尤其重要,向USP 提交的文件应该注明符合色谱法621 中常规测试章节中的有关系统适用性的要求。

《中华人民共和国药典》2015 年版通则9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”未对系统适用性试验进行单独论述,仅在耐用性项下提到:经试验,测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求。

 

2 系统适用性的要求

 

《中华人民共和国药典》色谱法项下系统适用性试验要求更加明确,但目前各论中收载的品种项下的系统适用性要求却是最低的。

《中华人民共和国药典》通则0502 薄层色谱法提到了系统适用性要求:

 

通则0512 高效液相法提到的系统适用性要求:

 

离子色谱法、分子排阻色谱法( 分离度一般应大于2. 0) 、气相色谱法、超临界流体色谱法、临界点色谱法等的系统适用性要求,除另有规定外,应照高效液相色谱法项下的规定。

USP 通则621 色谱法规定的系统适用性试验要求也包括理论板数、分离度、拖尾因子、重复性和灵敏度,但除100%含量测定重复性外,其他系统适用性参数均未给出明确规定。

BP2018 附录Ⅲ( Appendix Ⅲ) 色谱分离技术中对系统适用性要求也包括理论板数、分离度、拖尾因子、重复性和灵敏度。

BP 也仅对对称因子规定为0.8 ~ 1.5 之间,100% 含量测定重复性要求与USP41 规定一致,未对其他系统适用性参数作明确规定。

重新审视一下系统适用性试验的各参数,它们之间并非孤立的,而是相互影响、相互作用、相互关联。分离度Rs 是柱效N 的函数; 拖尾因子与重复性直接相关,并在一定程度上影响分离度; 灵敏度是保证上述所有参数有意义的基础。

因此,系统适用性试验要求,应该是一个整体的评价,而不是单独对某一个参数的要求。即便是拖尾因子,《中华人民共和国药典》2015 年版指出,除另有规定外,应在0. 95 ~ 1. 05 之间; BP 2018 规定应在0.8 ~ 1.5 之间。

但在实际运用过程中,并非所有系统适用性试验要求中拖尾因子都在上述范围内。在某些特殊情况下,是可以突破上述系统适用性的一般要求的。

如USP 41 收载的二甲双胍片溶出度检测方法3 中,系统适用性试验要求为: 拖尾因子NMT 2.0,柱效NLT 1 500。实验室工作曾经进行盐酸二甲双胍的溶出度研究工作。二甲双胍在较大浓度检测时,容易出现拖尾因子较大的情况。

所以,系统适用性试验作为分析方法不可或缺的一部分,应该是结合分析方法本身一起来考虑。系统适用性要求应该是以满足分析方法检测为目的。

 

 

3 系统适用性试验的必要性

 

USP 40 收载的谷胱甘肽有关物质方法如下:

系统适用性溶液: 取谷胱甘肽对照品、抗坏血酸对照品和D-苯甘氨酸对照品各适量,加水溶解并稀释制成每1 mL 中约含谷胱甘肽0. 5 mg、抗坏血酸0. 5 mg 和D-苯甘氨酸0.1 mg 的混合溶液作为系统适用性试验溶液。

系统适用性要求: 抗坏血酸与谷胱甘肽峰之间的分离度、谷胱甘肽与L-苯甘氨酸之间的分离度均不小于5,重复性不大于1. 5%。

根据谷胱甘肽的分子结构,谷胱甘肽属于在C18柱保留较弱的化合物,所以出峰时间较早,USP40 方法流动相中采用了离子对试剂来增加保留,改善分离。

然而,其保留时间也仅约为5 min( 色谱柱规格:15 cm × 4.6 mm,5 μm,L1) 。某厂家谷胱甘肽注册标准中,其他色谱条件与USP40 基本一致,规定调节流速使谷胱甘肽保留时间约为2 min。

分析出现上述差异的原因,主要有以下几个方面:

① 离子对试剂的质量差异。

② 流动相比例差异较大,由于操作而引入的系统误差。

③ 不同批号、型号色谱柱对谷胱甘肽色谱保留行为的差异。

④ 不同品牌仪器设备等造成的差异等。

通过对谷胱甘肽分析方法的分析以及实际的操作可知,此分析方法是属于对试验条件较为敏感的方法。对于此类方法,可以对敏感的试验条件给予更加具体的规定。但对离子对试剂的来源、因流动相比例差异大引入的系统误差、不同品牌仪器等难以具体要求,即便色谱柱可以规定品牌和型号,但也会给后续的方法转移和样品检测带来了诸多不便。因此,谷胱甘肽有关物质方法也未对上述条件乃至色谱柱加以规定。基于上述诸多问题,谷胱甘肽有关物质方法开发者们最终采用规定系统适用性试验参数的办法来解决方法重复性的问题,最终方法的准确性和精密度得到验证,方法得以被USP 收载。本文从USP41 按顺序查找了abacavir sulfate,abiraterone acetate,acebutolol hydrochloride,acepromazine maleate,acetaminophen,acetazolamide 和acetylcysteine的含量测定方法,上述含量测定方法均规定了系统适用性试验要求,具体见表1。

 

 

4 小结

 

系统适用性试验作为分析方法不可分割的一部分,已经被越来越多的监管机构所重视。但从目前国内整体的药物研发情况来看,分析方法开发者们对此还没有足够的认识。药物分析工作者们急需提升观念,提高重视程度,加强研究。

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