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关于无菌制剂阳性样品,你需要了解这些

CDE近期发布的《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南(征求意见稿)》中,关于包装密封性检查方法验证章节指出,要重点关注方法灵敏度的考察,需设立阴性及阳性对照样品。阳性对照系指采用激光打孔、微管/毛细管刺入等方法制造已知泄漏孔隙的包装容器。
从去年年初开始,CDE就陆续发补了关于包装密封完整性方面的内容,涉及到阳性样品的典型发补内容如下:
1、对验证所用的真空泄漏染色法和微生物侵入法,需结合理论测算泄漏尺寸进行实际阳性对照试验的确认(应注意阳性对照泄漏空隙尺寸选择的合理性),以进一步确认检测方法的灵敏度。必要时还需对两种方法进行对比,进一步确认泄漏风险与检出能力的关系;
2、微生物挑战法与物理检查法均需制备合适的阳性对照(制备系列打孔样品,测定实际泄露孔径),验证方法灵敏度,合理设计样本量;
3、建议采用两种方法对比验证,验证过程中应设定阳性对照组,同时关注验证方法的灵敏度;
4、建议参照USP<1207、1207.1、1207.2、1207.3>或注射剂相关行业指南继续完善容器密封性验证研究资料,评估包装容器对样品的保护性和适应性。验证方法可采用确定性检漏方法(如:激光顶空法、真空衰减法)和 概率性检漏方法(如:微生物侵入法、色水法),同时设立阳性对照组进行对比验证(包括方法的灵敏度)。若采用概率性检漏方法验证,请明确验证样本量的依据。
结合CDE目前的技术指南(征求意见)和之前发补意见,无论选用哪种方法,都要通过阳性对照来验证方法的灵敏度。所以阳性样品的制备就显得尤为关键。今天着重介绍一下这方面内容。
阳性对照:阳性对照是一个有已知的、故意缺陷的包装。用于泄漏试验方法开发和验证研究的阳性对照应在构造材料、 包装组合和组件加工方面复制研究阴性对照。阳性对照在泄漏试验方法的开发和验证过程中使用。一些测试方法也需要在常规测试中使用阳性对照。
常见的阳性样品制备方法:
1、激光打孔(Laser Drill)
激光打孔技术,是FDA推荐、USP1207引用的权威的阳性样品制备技术,本次在CDE技术指南征求意见稿中也被重点提及。
将一定波长的激光束施加在包装系统表面的一个点上。激光束被吸收,并在点上产生热量,材料被熔化、汽化。钻孔的速率可以通过激光束参数控制,但孔的深度无法控制。因此,对于壁厚不均匀的包装材料,只能通过试错方法创建所需的孔大小。
激光钻孔的几何形状是一个锥形孔,部分突出到侧壁, 并导致微小裂缝,形成一个扭曲不规则的通道。对于玻璃材质包装材料,当玻璃获得热量时,会产生微小裂纹。如果光学显微镜下观察达到所需的直径尺寸,即允许激光束穿过玻璃壁的整个厚度,则整个孔的流量将显著高于预期,因为孔周围会存在裂纹。
以上述标称5μm直径孔径为例,电子显微镜下观察,玻璃并没有完全被钻透(见下图(a为平面图,b为纵面图)):
为了获得相当于 5μm孔径的尺寸,应在玻璃壁中间停止钻孔,从钻孔中产生的裂缝将提供相当于目标缺陷尺寸的流量(见下图(d为c的局部放大图)):
如上所述,很难定义激光打孔的几何形状,因为它们实际上是一系列裂纹。根据大量的试验数据,建立了流量气体泄漏率与孔径尺寸关系如下表:
气体泄漏率和相对应的泄漏孔径尺寸的数据参考国内外相关指导原则,对应关系在理论上是大致相当,而非绝对。具体数值会随产品包装、检测仪器、检测方法参数和测试样品制备等不同而变化。
根据标称孔径尺寸和泄露气体流量之间的关系,通过计量气体泄漏率,可以推算出缺陷的标称尺寸,并可以提供校准计量证书。
激光打孔相比其他制备方法的优势在于:漏孔几何形状和内部气体流动行为最接近真实缺陷,激光打孔产生的泄漏通道是不规则的曲折通道,非常接近真实的缺陷(如下图)。不需要引入可能影响泄露检测的其他物质(线、管、环氧树脂等)。每一个漏孔都有漏孔校验证书,确保漏孔尺寸可追溯。
当前,激光打孔技术在硬质玻璃或塑料材质上最小可打的孔径大约是3±1μm。但同时激光打孔制备阳性样品的费用较高,孔径大小需要校准,比较小的漏孔很容易被环境的灰尘杂质堵塞,柔性包装材质测试变形也会造成孔径堵塞或公差变化。
通过上述介绍,激光打孔的阳性样品是选择流量计量还是光学计量,相信大家已经做到心中有数了。两种计量方式与泄漏率的对比线性情况如下:
(以上数据来源于网络)
2、玻璃微滴管(Glass Micropipette)
如产品包装系统为模制玻璃瓶(壁厚)、易变形材质如输液软袋等不适合激光打孔技术,可选用玻璃微滴管方式制作阳性样品(见下图):
玻璃微滴管的孔径可以低至0.1μm,但尖端非常脆弱,因此在样品制备过程中很容易损坏。周围使用环氧树脂密封完成后,应用显微镜观察,验证其密封完整性。锥形尖端内径的公差通常±20%。比如上述2μm玻璃微滴管的通道长度很难定义,一般假定它短于 0.5mm 。另外残存的空气会干扰测试结果。下图显示了玻璃微滴管尖端的图像。
2μm 玻璃微滴管尖端的图像(光学数字显微镜 X4000)
3、微管/毛细管(microtube)
微管,又称毛细管,几何形状是一个内径中空的圆柱体。是由石英材料制造,外部有熔融的聚合物涂层,兼具强度和弹性,所以制作阳性样品时可以很容易地处理,可以尽量减少破损。材料获取比较方便,大于0.2μm的孔径都可以制备。这种材料之前应用相对广泛,就不在详细介绍。该方法的缺点是长度相对漏孔尺寸大很多,几何形状与现实缺陷差别较大,导致用于微生物挑战试验时验证的灵敏度相对较低。
此外还有铜丝压线等制备阳性样品方法,与激光打孔阳性样品对比,微生物挑战阳性概率不同(见下表):
关于阳性样品常见问题:
1. 激光打孔阳性样品能否重复利用,如何保存?
由于阳性样品的孔径较小,容易堵塞,一般不建议重复利用;
如样品用于确定性方法开发验证,未被破坏,可用于概率性方法(色水、微生物挑战)。如用于概率性破坏性方法,漏孔接触水溶液后,则禁止重复利用;
样品不能长时间暴露在空气中,严禁暴露在灰尘环境、高压流量环境中,建议密封在洁净包装内保存;
使用过程中严禁用手直接接触阳性样品,特别是漏孔部位。建议操作人员戴干净手套后接触阳性样品;
样品如长时间未使用,复验期建议为6个月。
2、做微生物挑战实验用的激光打孔阳性瓶在灭菌过程中没有变化呢?
对玻璃安瓿瓶样品使用激光打孔技术制备5μm的孔径,按照正常灭菌程序处理,通过显微镜下可以观察到(见下图),处理前后的变化较大,有堵孔现像。
3、在开展物理方法和微生物方法的比对时,使用毛细管(内径10μm,长度5mm)方式制作阳性样品,在微生物方法中为阴性(未见有菌生长)。是否有相关的经验可以借鉴?
使用毛细管(微型管)法制备阳性样品,其毛细管的长度、管内是否含有气体,都会对微生物的侵入产生较大的影响,并可能产生假阴性的结果;故阳性样品的制备非常重要,一方面要尽量模仿产品实际泄漏的情况,一方面要避免产生假阴性结果的影响因素,如避免毛细管过长(尽量接近包材本身的厚度)或避免管内含有气体。另外,还可以在外部施加一定的压力,以保证微生物的检出概率。
4、关于阳性样品数量参考依据?
关于无菌制剂包装完整性测试,不同的方法所需阳性样品数量不同,目前暂无统一的数量要求。不同的方法应根据批量、包装规格的不同,设定不同的抽样标准。微生物挑战法可参考USP文献每个泄露级别至少10支数量。
稳定性阶段推荐 测试作为无菌试验的替代,其样品量的选择也可参考 《中国药典》(第四部 1101)中对于无菌试验阳性样品数量规定。对于大部分情况而言,每个泄露级别至少20支数量。
如选用概率性方法进行包装密封完整性的测试,选用的阳性样品数量需结合各种参数进行同步设计,以保证试验方案的顺利完成。
参考文献:
1、《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南(征求意见稿)》
2、Development of a Dye Ingress Method to Assess Container-Closure Integrity: Correlation to Microbial Ingress, PDA J Pharm Sci and Tech 2000, 54 449-455
3、Pharmaceutical Container/Closure Integrity VI: A Report on the Utility of Liquid Tracer Methods for Evaluating the Microbial Barrier Properties of Pharmaceutical Packaging PDA J Pharm Sci and Tech 2000, 54, 305-314
4、Developmentof a Dye Ingress Method to Assess Container-Closure Integrity:  Correlation to Microbial Ingress
5、Jayshree Patel,Brian Mulhall,Heinz Wolf,et al.PDAJPharm Sci and Tech 2011,65486-505Access the most recent version at doi:10.5731/pdajpst.2011.00780
6、FDA <Guidance for Industry: Container and Closure System Integrity Testing in Lieu of Sterility Testing as a Component of the Stability Protocol for Sterile Products>(2008)
7、U.S. Pharmacopeia–NF, 2011, USP 34 1207 Sterile Product Packaging—Integrity Evaluation, p 759.
8、Karniadakis, G. E.; Beskok, A. Micro Flows:Fundamentals and Simulation; Springer: NewYork, 2002.

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